Competizione interspecie nei biofilm orali mediata dalla deossiribonucleasi extracellulare di Streptococcus gordonii SsnA

npj Biofilm e microbiomi volume 8, numero articolo: 96 (2022) Citare questo articolo

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Il DNA extracellulare (eDNA) è un componente chiave di molti biofilm microbici, inclusa la placca dentale. Tuttavia, i ruoli degli enzimi extracellulari deossiribonucleasi (DNasi) all’interno dei biofilm sono poco conosciuti. Lo Streptococcus gordonii è un pioniere colonizzatore della placca dentale. Qui, abbiamo identificato e caratterizzato SsnA, una proteina associata alla parete cellulare responsabile dell'attività DNasi extracellulare di S. gordonii. L'attività della DNasi extracellulare mediata da SsnA di S. gordonii è stata soppressa in seguito alla crescita degli zuccheri. La SsnA è stata purificata come proteina ricombinante e si è dimostrata inattiva al di sotto di pH 6,5. SsnA ha inibito la formazione di biofilm da parte dello Streptococcus mutans in modo pH-dipendente. Inoltre, SsnA ha inibito la crescita dei biofilm del microcosmo orale nella saliva umana. Tuttavia, l’inibizione è stata migliorata dall’aggiunta di saccarosio. Insieme, questi dati indicano che S. gordonii SsnA svolge un ruolo chiave nella competizione interspecie all'interno dei biofilm orali. L'acidificazione del mezzo attraverso il catabolismo degli zuccheri potrebbe essere una strategia per le specie cariogene come S. mutans per prevenire l'esclusione mediata da SsnA dai biofilm.

La cavità orale ospita tipicamente circa 100-300 taxa batterici diversi che colonizzano le superfici dei tessuti duri e molli1. La composizione tassonomica e la distribuzione dei batteri all'interno dei biofilm orali sono determinate da processi di adesione selettiva e interazioni competitive e mutualistiche tra le specie e l'ambiente fornito dall'ospite2,3,4,5. L’accumulo della placca dentale, il biofilm che si forma sulla superficie dei denti, avviene in modo ordinato spaziotemporalmente6. I colonizzatori pionieri in grado di aderire alla pellicola di smalto acquisita gettano le basi della placca dentale e forniscono recettori per il reclutamento di colonizzatori secondari, che alla fine portano allo sviluppo di comunità microbiche complesse e dinamiche7,8. I colonizzatori pionieri sono generalmente considerati commensali o addirittura utili per il mantenimento della salute orale2,9,10. Tuttavia, se la placca dentale non viene adeguatamente controllata, si può sviluppare carie dentale o parodontite11. Queste due condizioni sono responsabili della stragrande maggioranza della perdita dei denti in tutto il mondo12. La malattia è associata a cambiamenti nella composizione e nelle attività biochimiche della placca dentale che provocano uno stato di disbiosi13,14. Nel caso della carie dentale, l’eccessiva frequenza e/o quantità di assunzione di zuccheri nella dieta seleziona biofilm disbiotici arricchiti in batteri acidurici e acidogeni che riducono il pH sulla superficie del dente e guidano la demineralizzazione dello smalto o del cemento dei denti. L'ulteriore progressione della lesione provoca la distruzione della dentina e l'invasione di batteri nella camera pulpare15,16.

Colonizzatori pionieri come gli streptococchi del gruppo Mitis svolgono un ruolo importante nel controllo della crescita eccessiva di batteri più acidogeni e cariogeni come lo Streptococcus mutans. Ad esempio, lo Streptococcus gordonii esprime un sistema di arginina deaminasi (AD) che contrasta l'acidificazione del biofilm generando ammoniaca e anidride carbonica producendo energia per le cellule9,17,18,19,20. In presenza di ossigeno, S. gordonii e altri membri del gruppo di streptococchi Mitis, incluso Streptococcus sanguinis, producono quantità sostanziali (millimolari) di perossido di idrogeno (H2O2), che possono inibire la crescita di S. mutans21. Inoltre, è possibile che i colonizzatori pionieri competano con S. mutans per i siti di legame all'interno del biofilm. L'attaccamento di S. mutans dipende fortemente dalla presenza di saccarosio, che viene metabolizzato a livello extracellulare per produrre glucani che supportano l'adesione e la colonizzazione del biofilm22. In assenza di saccarosio, l'adesione di S. mutans sembra essere mediata dal DNA extracellulare (eDNA)23. Il DNA extracellulare è importante anche per l'integrità strutturale dei biofilm maturi di S. mutans poiché il trattamento con DNasi I determina la dispersione del biofilm24,25. È stato recentemente dimostrato che l'eDNA è presente in biofilm più complessi, inclusa la placca dentale di specie miste26,27,28,29,30,31. Il trattamento della placca dentale, in particolare nelle prime fasi di sviluppo, con enzimi DNasi esogeni riduce significativamente la biomassa del biofilm e impoverisce selettivamente alcune specie che sembrano essere particolarmente dipendenti dall'eDNA27,31,32. Inoltre, l’eDNA funge da fonte di nutrienti e serbatoio per il trasferimento genico orizzontale all’interno della placca dentale3,16.

10 kbp) was observed in extracts isolated from S. mutans biofilms but not in S. gordonii biofilms (Fig. 1a). The size of the fragment was similar to intracellular chromosomal DNA (iDNA) extracted from S. mutans cells. This band was not observed following enzymatic treatment of the extracts with DNase I (Supplementary Fig. 1). NanoDrop spectrophotometry analysis of the extracts showed eDNA represented approximately 19% of the total DNA (iDNA + eDNA) in S. mutans biofilms while it accounted for only 6% of the total DNA in S. gordonii biofilms. The role of eDNA in maintaining the integrity of S. mutans and S. gordonii biofilms was investigated by treating pre-formed S. mutans and S. gordonii biofilms with 5 µg/mL DNase I for 1 h at 37 °C (Fig. 1b, c). Crystal violet staining revealed that DNase I treatment significantly reduced S. mutans biofilm biomass by >90%. By contrast, S. gordonii biofilms were not affected by DNase I treatment. Inclusion of DNase I during biofilm development significantly inhibited the accumulation of S. mutans biofilms but did not affect S. gordonii (Fig. 1d)./p>30-fold after 25 h (Fig. 3c)./p>50% in the presence of glucose, maltose, galactose, fructose or inulin. Streptococci produce acid from sugars and it was possible that the DNase enzyme activity may have been affected by the pH of the cultures. The pH of supernatants from stationary phase S. gordonii BHY cultures was approximately 5.6, whereas the pH of cultures grown with galactose was approximately 4.6 (Fig. 4b). The pH was further reduced to between 4 and 4.2 in cultures grown with glucose, maltose, fructose or inulin. To assess the impact of low pH on DNase activity, BHY was amended to pH 5.5 by the addition of HCl and used to culture S. gordonii cells to stationary phase. The final pH following growth was approximately 4.2 and almost no DNase activity was detected in cells grown in acidified BHY (Fig. 4)./p>1.28 mM MnCl2)./p>64 μM Mn2+ or >40 μM Zn2+. Low concentrations (40 μM) of the chelating agent EDTA were included in these experiments to remove trace metals associated with the enzyme or DNA substrate. It is possible that Zn2+ displaced Mg2+ or Ca2+ from the EDTA, indirectly activating the enzyme. At higher concentrations, Zn2+ in particular appears to be a potent inhibitor of SsnA. This is consistent with other DNase I family enzymes including human DNase I that are inhibited by Zn2+55. On the other hand, we speculate that the decrease in the activity at higher Mn2+ concentrations may be caused by significant binding of Mn2+ to the DNA substrate, interfering with the enzyme's recognition/interaction. Concentrations of Zn2+ in saliva are in the order of 0.2–1.2 μM, whereas Ca2+ is present at approximately 0.5–2.75 mM and Mg2+ at 7–30 μM56. These concentrations would potentially support activity of SsnA in oral biofilms./p>

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